1 范围

本标准规定了蛋禽H5亚型禽流感免疫抗体卵黄检测技术中的样本采集、实验准备、实验方法、结果判定等操作方法。

本标准适用于用卵黄进行蛋禽H5亚型禽流感灭活疫苗免疫抗体检测。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单位（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究可以使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术

3 术语和定义

下列术语与定义适用于本标准。

3.1 蛋禽 已经产蛋的家禽。

3.2 检样 经过直接稀释或氯仿萃取制备好的、用于检测的样品。

3.3 跳管 血凝抑制试验中，同一检样在反应板上出现的前、后孔凝集抑制而中间孔凝集的现象。

4 样本采集

采集蛋禽免疫接种H5亚型禽流感灭活疫苗21d后所产的新鲜禽蛋。

5 实验准备

5.1 材料准备

5.1.1 仪器设备

96孔90οV型微量反应板、微量移液器、滴头、微量振荡器、离心机、液体快速混合器、容量瓶。

5.1.2 试剂

a) 葡萄糖、柠檬酸钠、柠檬酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸等。

b) 禽流感病毒H5亚型HI抗原、禽流感病毒H5亚型阳性血清和阴性血清。

5.2 试液配制

5.2.1 阿氏（Alsevers）液配制

称取葡萄糖 2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml容量瓶中，定溶，散热溶解后调PH值至6.1，69kPa15min高压灭菌，4℃保存备用。

5.2.2 1%鸡红细胞悬液配制

采集至少三只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合，用PH7.2 0.01mol/L PBS洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成1%(V/V)红细胞悬液，4℃保存备用。

5.2.3 0.01mol/L PBS试液

a) 称取磷酸氢二钠2.74g，磷酸二氢钠0.79g，用适量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，定溶。

b) 量取上述溶液40ml，加入氯化钠8.5g溶解后，移入1000mL容量瓶中，定溶。

c) 用0.01mol/L氢氧化钠或0.01mol/L盐酸调PH至7.2，高压灭菌备用。

5.3 检样制备

5.3.1 卵黄直接稀释

在样品管中加入0.5mlPBS液，再吸取0.5ml卵黄做1:1稀释，混匀制成卵黄检样备用。

5.3.2 卵黄氯仿萃取

取5.3.1制备好的卵黄检样0.4ml加入等量氯仿，迅速用液体快速混合器充分振荡混匀，室温静置30min，3000r/min离心5min，取上清液备用。

6 实验方法

6.1 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）

操作方法按GB/T18936执行。

6.2 血凝抑制（HI）试验（微量法）

6.2.1 卵黄直接稀释测定法

操作方法按GB/T18936执行。用5.3.1中制备的卵黄检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血清和阴性血清对照。

6.2.2 卵黄氯仿萃取测定法

6.2.2.1 适用范围

在卵黄直接稀释测定法检测出现“跳管”或测不出抗体时，采用卵黄氯仿萃取法检测。

6.2.2.2 方法

操作方法按GB/T18936执行。用5.3.2中制备的检样代替血清进行检测。检测时设标准阳性血清和阴性血清对照。

7 结果判定

7.1 试验结果成立条件

只有阴性对照孔血清滴度不大于22，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。

7.2 HI滴度的计算方法

以完全抑制4个HAU抗原的样本最高稀释倍数作为HI滴度。样本制备过程中卵黄的稀释倍数和加入氯仿量都计入该样本的稀释倍数。

7.3 判定方法

7.3.1 卵黄直接稀释测定法结果判定

将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计入终点滴度判定，即：微量反应板上血凝抑制的终点滴度加一个滴度为该样本的HI抗体效价（终点滴度为零时则不再加）。举例：微量反应板上血凝抑制的终点滴度是27，则该样本HI抗体效价为28。

7.3.2 卵黄氯仿萃取测定法结果判定

将“检样制备”过程中样本的稀释倍数计入终点滴度判定，即：微量反应板上血凝抑制的终点滴度加两个滴度为该样本的HI抗体效价（终点滴度为零时则不再加）。举例：微量反应板上血凝抑制的终点滴度是27，则该样本HI抗体效价为29。

8 免疫抗体合格判定

8.1 个体合格判定

样本HI抗体效价大于等于24为免疫合格。

8.2 群体合格判定

免疫合格样本数占检测总样本数70%以上（包括70%）判为群体合格。

河北省地方标准DB13/ 946—2008

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