PCR（Polymerase chain reaction）又称聚合酶链式反应，是模拟DNA的复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的方法，从而获得大量的同一序列DNA。1971年，Khorana等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA的设想。1983年，Cetus 公司的 K.Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。1988年，Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术 。1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。
      一．PCR技术的基本原理

      1. PCR又称无细胞分子克隆法：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，四种脱氧单核苷酸，耐热性多聚酶，一对合成DNA的引物，通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过30次循环，理论上扩增产物量成指数上升，既n个循环后，产量为2n拷贝。

                                                   30次循环后靶序列扩增的数量

循环数 目的基因扩增的数量 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824

      2.PCR的基本步骤
     （1）PCR反应体系的建立
      取0.2ml的薄壁离心管，将模板DNA、ddH2O、dNTPs (2.5mM each)、反应缓冲液、Taq DNA聚合酶、上下游引物按顺序加入试剂，稍混匀，短暂离心，把溶液甩至管底。
     （2）PCR的变温程序（热循环反应）
      将上述试剂放入PCR仪中，按PCR反应的变温程序进行扩增。反应结束后低温保存或检测
     （3） PCR扩增产物的电泳检测
      三． PCR技术在动物疾病诊断中的应用
      1. 诊断RNA病毒病
      兽医临床上，严重危害鸡群及猪群健康的重大疾病多为RNA病毒，如禽流感(AI)、新城疫(ND)、传染性支气管炎(IB)、禽偏肺病毒（APV），猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、伪狂犬病毒（PRV）等。应用PCR技术对这些疾病进行诊断，具有重大意义。检测RNA的PCR技术称为RT-PCR技术，该反应可分为两个步骤：第一步，在单引物的介导和反转录酶的催化下，合成RNA 的互补链cDNA；第二步，加热后cDNA 与RNA 链解离，然后与另一引物退火，并由DNA 聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后像一般的PCR 一样，扩增靶DNA。
     例如，在禽流感的诊断中，用RT-PCR方法将决定病毒毒力的HA切割位点进行测序，将其用于实验感染病毒株或弱毒株的检测，RT- PCR均能检测出HA基因，甚至在其他标准试验检测为阴性的样品中也能检测出。将RT-PCR结合HA酶切位点的序列测定，对于评估AI病毒毒力提供了一种快速敏感的方法。陈化兰等首次建立了稳定可靠的RT-PCR方法扩增HA全基因，为其他亚型和毒株的基因体外扩增提供了手段。
       2. 诊断DNA病毒病
       鸡最常见的DNA病毒病为马立克（MD），禽白血病（ALV）、网状内皮增生症（REV）；猪最常见的DNA病毒为圆环病毒；牛最常见的DNA病毒为牛结核病毒。例如，在MDV-1基因组的Bam HI和Bam HD片段内有一保守的132 bp重复序列，强毒株一般有2～3个重复，而弱毒株则有3个以上的重复拷贝数，通过产物的重复序列可以进行区分。Becker等用PCR将致病和非致病的马立克病毒血清I型、疫苗株Ⅱ型进行比较，结果表明，PCR可以对样品中的马立克病毒血清I型和疫苗株进行早期鉴别。韦平等根据基因组特征，以PCR为基础，建立一种能快速鉴别MD、ALV和REV这3种常见鸡病毒性肿瘤病的三重PCR，该方法可对3种病原进行一次PCR 扩增，在此基础上又研制了鸡病毒性肿瘤快速鉴别诊断试剂盒。
       3. 诊断其它病原体性疾病
       PCR技术在检测其它病原体性疾病方面也有广阔的前景。高以明等根据已发表的禽鸡毒支原体(MG)和滑膜囊支原体(MS)的基因文库，利用oligo5．0设计共同针对MG、MS模板的一对引物，通过PCR扩增，电泳分析，MG检出率为l0．25％ ，分离培养的阳性符合率为100％。
       四．PCR技术应用前景
       PCR技术在动物疫病研究和诊断方面，已成为非常实用的工具，PCR技术无疑将广泛地应用于兽医学领域，包括诊断病原、基因表达、遗传病检测、肿瘤细胞监测等方面。以PCR为基础的一系列实验已成为常规检验手段，运用多重PCR技术快速诊断不同病原的方法正不断建立，PCR尤其适用于许多持续性病毒感染的慢性疾病，对于不能产生炎症反应的新病毒和检测丢失某些基因的病毒，是目前PCR研究领域的新课题。随着研究的深入，PCR技术将更趋于自动化、标准化、简洁化，拥有更为广阔的前景。（ 山东益生畜禽疾病研究院  李玉燕 ）

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