禽坦布苏病毒（Avian Tembusu virus，ATMUV）为黄病毒科黄病毒属成员，是自2000年以来我国新发现的以蛋鸭产蛋率、采食量显著下降，出现脑炎样神经症状为主要临床特征和以出血性卵巢炎为主要病变特征的传染病。由该病毒引起的鸭传染病被称为鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu virus disease，DTMUVD）或鸭坦布苏病毒感染。该病曾被命名为鸭黄病毒病、鸭出血性卵巢炎、鸭病毒性脑炎、鸭鹅脑炎-卵巢炎综合征、鸭产蛋下降-死亡综合征等。鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）的发病率高达100%，死亡率在5%~15%之间。该病毒除感染蛋鸭外，还可感染鹅、鸡、肉鸭等禽类。该病发病急、传播快，目前全国大部分水禽养殖地区均已受到该病毒的威胁，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前尚没有针对性的治疗该病毒感染的药物，亦缺乏有效的疫苗。对于该病的诊断，根据临床症状、病理变化和流行情况可做出初步诊断，但要确诊需要对病毒进行实验室检测。因此，加强对该病毒检测方法的研究，建立快速、准确的检测方法，对控制疾病的发生，保护和促进水禽养殖业的健康发展，具有重要意义。本文对近年来禽坦布苏病毒的实验室检测方法研究进展作一简要概述，以期为疾病的深入研究和有效防控提供参考。

1 病毒分离鉴定

    病毒分离鉴定是动物病毒病最为经典、准确、可靠的病原学诊断方法。对于ATMUV而言，发病鸭的卵泡膜、肝脏、脾脏等病变组织均可作为病毒分离的样品，鸡胚、鸭胚、鸭胚成纤维细胞均可用于病毒的增殖。病死鸭的出血卵泡膜和卵巢是用于病毒分离的最好组织，其病毒分离率最高，采集这些组织病料，按常规方法匀浆后反复冻融3次，除菌过滤后，经尿囊腔无菌接种9~10日龄SPF鸡胚或10~12日龄鸭胚，接胚后3~6d胚胎死亡，有的需要盲传2~3代以上胚胎才出现死亡。

    死胚充血、出血，肝脏出血，肾脏有尿酸盐沉积，尿囊液黏稠，并含有大量尿酸盐。分离毒进行血凝试验，鸭坦布苏病毒没有血凝活性，而流感病毒、鸭副黏病毒、EDS76均具有血凝活性，可以此鉴别区分这几种病毒。分离毒可采用电镜、RT-PCR、血清中和试验、免疫组化等技术进行鉴定。目前，已有多株鸭源、鹅源、鸡源坦布苏病毒成功分离的报道。万春和等、李玉峰等分别从产蛋骤降的病死种蛋鸭的卵巢、脾脏、卵泡膜、脑膜、脑组织等病变组织成功分离到多株DTMUV。黄欣梅等、潘金金等从病鹅的肝脏、脾脏等病变组织成功分离到ATMUV。陈仕龙等从发病蛋鸡的卵巢、输卵管、肝、脾等病变组织中成功分离到3株ATMUV。病毒分离方法准确性高、可靠性强，但试验周期较长、操作较复杂，且分离到的病毒需要电镜、PCR等方法进行后续鉴定，故该方法只适合有一定技术条件的实验室应用。

2 血清学检测

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

    到目前为止，国际上通用的黄病毒属血清学检测方法有ELISA、琼脂扩散试验（AGP）、血凝抑制试验（HI）、补体结合试验（CF）和中和试验（NT）等。AGP操作比较简单，但耗时长，而且敏感性较低。ELISA是血清学方法中最常用的，其优点是特异性强，灵敏度高及检测速度快，特别适用于大批样品的血清学检测。Ｅ蛋白是坦布苏病毒主要的结构蛋白，不仅含有病毒的中和性抗原表位，而且是病毒的主要毒力蛋白。根据其他黄病毒的研究结果可知，Ｅ蛋白与病毒的吸附、穿入、致病性、组织嗜性、血凝反应、血清特异性和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。因此，Ｅ蛋白可作为抗原而建立检测DTMUV的ELISA方法。姬希文等成功地研制出了针对E蛋白的中和性单克隆杭体，同时以纯化的奉贤株（FX2010）作为包被抗原，建立了检测DTMUV血清抗体的间接ELISA法。应用该方法与AGP同时检测140份临床鸭血清样品，间接ELISA检测出阳性108份，AGP检测出阳性32份。两者的阳性符合率为100%，阴性符合率为87.5%。表明其所建立的间接ELISA检测方法显示出了极高的敏感性、特异性、重复性，可用于DTMUVD的快速诊断、抗体监测和流行病学。陆新浩等应用该法对宁波地区的多个发病鸭场的发病后15~60d的鸭进行检测，发现发病后15d鸭的血清阳性率均达100%。施少华等、杨少艳等、郝明飞等也先后于2012年建立了关于E蛋白的间接ELISA方法并用于临床检测，结果均表明该方法具有很好的应用价值，可了解群体ATMUV的感染情况，为制定合理的防制措施提供参考。Li等以ATMUV的E蛋白单克隆抗体为阻断抗体，建立了检测ATMUV抗体的液相阻断ELISA方法，该方法与鸡胚中和试验方法的符合率高达70.6%。钮慧敏等利用纯化的鹅源坦布苏病毒JS804株E蛋白作为包被抗原，建立了检测鹅源坦布苏病毒抗体的间接ELISA，并对各种检测条件进行了优化。坦布苏病毒感染哺乳动物后可形成分泌型NS1蛋白，在未出现临床症状之前即可检测到分泌型NS1蛋白。NS1蛋白作为坦布苏病毒病的一种潜在诊断标志物，其蛋白水平与病毒致病严重程度有关，可应用于坦布苏病毒感染的早期诊断。谢星星等以纯化的NS1蛋白包被酶标板，建立了检测TMUVD抗体的间接NS1-ELISA方法。该方法适宜于现场及实验室TMUVD抗体的检测，为坦布苏病流行病学调查和有效防治提供了一种快速有效的检测方法。ELISA方法特异性、灵敏性较高，操作简便，但是存在各种干扰因素，影响结果的准确性。

2.2 乳胶凝集试验（LAT）

    LAT具有准确灵敏、简便易行、特异性强等优点，被广泛应用于畜禽传染病的血清学检测。万春和等研制出DTMUV乳胶诊断试剂，并建立了检测DTMUV的LAT方法，与间接ELISA方法检测的阳性符合率达85.3%，且具有操作简便、结果直观易判定（不需特殊仪器，仅凭肉眼观察即可）、快速（临床上5min内即可做出准确判定）、特异性强、重复性好等优点，特别适于临床和基层快速诊断、血清流行病学调查。

3 分子生物学检测

3.1 RT-PCR技术

RT-PCR技术具有简便、快速、敏感、特异等优点，是实验室常用的分子生物学检测技术，在ATMUV的快速检测中得到了广泛应用。胡旭东等、Su等、李国平等、万春和等以及曹贞贞等分别根据E、NS1、NS3、NS5等基因保守序列，设计引物，建立了可直接检测坦布苏病毒的RT-PCR方法。张帅等建立了该病毒的一步法RT-PCR检测方法，对2010~2011年收集的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测，结果显示样品阳性率为46.2%，表明DTMUV在我国产蛋鸭群中具有较高的感染率。傅光华等所建立的连接酶依赖RT-PCR方法具有快速、敏感、特异等优点，可用于ATMUV的流行病学调查及病毒检测。RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性，而套式RT-PCR方法则具有更高的敏感性。刁有祥等应用建立的半套式RT-PCR方法对20份疑似DTMUV感染的病料进行检测时发现，半套式RT-PCR可以检出16份，而常规RT-PCR只能检出5份。颜丕熙等、唐熠等成功建立了检测ATMUV的套式RT-PCR方法，比常规RT-PCR敏感性高10倍，且临床样品检出率高于病毒分离率。黄欣梅等建立的检测ATMUV的套式RT-PCR方法的灵敏度达101.89TCID50/0.1mL，比常规RT-PCR方法的敏感性高1000倍，应用该方法对江苏地区疑似ATMUV感染的70份鹅病料、4份鸭病料、12份鸡病料进行检测，总阳性率达58.14%，明显高于常规RT-PCR方法检测的阳性率（17.44%），将为该病的防控发挥重要作用。

3.2 实时荧光定量RT-PCR技术

实时荧光定量RT- PCR技术融合了常规RT-PCR技术的高灵敏性和光谱技术的高精确定量的特点，具有定量准确、灵敏度高、特异性强、速度快、自动化等优点，实现了PCR扩增反应的实时跟踪和定量检测，是当前动物疫病检测技术中简单、快速、敏感、特异的定量检测技术。Yan等建立了针对E基因的TaqMan探针荧光定量RT-PCR，该方法比常规RT-PCR敏感100倍，最低可检测到50个拷贝的病毒核酸。Yun等针对3′端非编码区设计的MGB探针，建立的检测ATMUV的荧光定量RT-PCR方法，包括核酸的提取过程在内，2h内即可完成。李庆阳等建立的荧光定量RT-PCR测方法敏感性最低为10copies/μL。于春梅等、万春和等建立了基于坦布苏病毒NS5、E基因的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR的方法，可实时定量分析病毒核酸在动物体内的含量来明确其病毒感染程度，同时为疾病的早期诊断提供重要参考。靳宇田等、彭珊、高凤等于2013年先后建立ATMUV的荧光定量RT-PCR方法，与病毒分离鉴定的符合率高达100%。实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度和特异性高，可对病料和未知样品的组织进行实时监测和定量检测，不仅丰富了DTMUV的分子生物学检测方法，为该病毒的进一步研究奠定了基础，更加适于推广和应用于兽医临床诊断工作中。但该技术所需试剂与仪器均较昂贵，且对操作人员要求较高，限制了其在基层及一般实验室的普遍应用。

3.3 环介导等温扩增（RT-LAMP）技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）技术因其具有无需PCR仪等特殊仪器设备、操作简便、反应迅速、肉眼判读、成本低廉、特异性强、灵敏度高等优点，特别适合在现场和基层部门使用，具有广阔的应用前景。Wang等建立了针对DTMUVE基因的RT-LAMP方法，在63℃水浴50min内即可完成扩增，比常规RT-PCR方法敏感80倍，可检测到2拷贝/μL病毒核酸。Tang等建立的RT-LAMP方法，灵敏度达45拷贝/μL，检测常见10种禽病病毒均为阴性。李兆龙等建立的RT-LAMP方法在常规水浴锅中45min内即可完成，灵敏度达1pg，比常规RT-PCR方法高100倍。欧全宾等、张伟等建立的RT-LAMP方法，敏感性高、能避免交叉污染，具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力，能够为从源头遏制该病的发生和蔓延提供有效的手段。韩凯凯等针对鹅坦布苏病毒NS5基因序列保守区域的RT-LAMP方法，表现出较高的灵敏度，是常规RT-PCR的100倍。LAMP技术的不足之处在于其极易造成假阳性结果的出现。

4 核酸探针技术

核酸探针技术不受抗原抗体反应的限制，不需要特殊设备，一次可以检测多个样品，操作简单，结果易于判定，具有准确、快速、重复性好的优点，也是目前常用的分子生物学检测技术，适合在基层推广使用。高绪慧等利用RT-PCR方法扩增DTMUV的NS3基因406bp的特异性片段，回收并纯化PCR产物，用地高辛标记，制备核酸探针。试验结果表明，该探针具有良好的特异性；该探针对DTMUV的RNA最低检出限量为100μg/L。对疑似DTMUV感染鸭的肝脏、肺脏、脾脏、输卵管、卵泡膜和泄殖腔棉拭子进行检测，以卵泡膜的检出率最高。

5 存在的问题与展望

禽坦布苏病毒病自暴发以来，在短时间内迅速波及我国15个沿海省份及周边地区内饲养的家禽，给养禽业造成了巨大经济损失，而且该病仍在家禽中流行。因此，建立快速、敏感、特异的DTMUV检测方法，加强该病的流行监测，掌握该病的流行趋势及该病毒分子遗传变异的规律，是该病临床诊断、防疫与检疫的迫切要求，将有助于降低对该病在家禽的流行，并促进研制有效防控该病的疫苗。目前针对该病毒已建立了多种检测方法，这些方法的使用极大的方便了该病的及早诊断，使疫情得以有效控制。然而这些方法各自存在不同的优缺点或苛刻要求，如有的存在操作繁琐、受检测材料限制、有的试验周期较长、有的对试验仪器及检测人员技术要求高等，这就需要实验室检测人员根据各自条件，综合选择并建立合适的检测方法。另外，随着分子生物学的发展和人们对DTMUV研究的不断深入，相信不久的将来，更多更为高效、敏感、特异、快速、简易而且价廉的检测方法将会被建立起来。

-----本文选自《中国家禽》杂志

 鸭黄病毒治疗方案：

A、抢救方案，对于个别严重的卧在地上不愿走动，基本不能喝水吃料的，用清灵+ 新六甲+头孢噻呋联合皮下注射。

大群解决方案：确实有效的防控方案（鸭黄病毒综合防治“傻子”方案=1+1+1+1）： 驰骋芪贞颗粒 ＋支大净或替嘉康＋肠欣安+ 新力爽或 EAD ”，将全天用量集中1次在3个小时饮完，连用 4 - 5天。下午在饮水或饲料中添加补特佳连用7天；

B、新常态下鸭鹅病的流行情况：水禽黄病毒、鸭坦布苏病毒、传染性浆膜炎病的高发期，为了避免或减少养殖肉鸭肉鹅的朋友，经济少受损失，水禽疫病防控专家魏老师建议：在肉鸭、肉鹅 7-9日龄、18-20日龄、28-30日龄，这三个重要的时间段，准时投喂“驰骋芪贞颗粒+四季安或养乐多+好得快或替嘉康”即可达到防控黄病毒、坦布苏病毒的发生和流行。

● 蛋鸭、种鸭产蛋下降防控方案：

河南豫北水禽疫病快讯：种鸭采食量不减，拉稀、产蛋量下降，薄蛋壳、沙壳蛋、小蛋等症状；魏老师建议用药治疗方案：驰骋芪贞颗粒+替嘉康+肠欣安+新力爽混合饮水，每天一次，连用5天；（5天后用养殖安拌料；驰骋钙+EAD100混合饮水，连用7天）预防方案：定期在饲料中添加1%养殖安+消疫康+EAD混合拌料，预防效果不错！

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