鸡新城疫微量红细胞凝聚抑制试验

A 微量血凝板：V型、96孔；B 微型振荡器；C 塑料采血管；D 移液器：50ul E：离心机 F: 1ml移液管

B2 试剂：

B2.1 稀释液

PH7.0-7.2磷酸缓冲盐水、氯化钠（GB166-77）170g、磷酸二氢钾（GB1274-77）13.6g、氢氧化钠（GB629-77）3.0g、蒸馏水1000ml

高压灭菌，4℃保存，使用时作20倍稀释

B2.2 标准抗原或新城疫疫苗冻干苗 Ⅴ系每瓶加注射用生理盐水或稀释液1ml稀释。

B2.3 1%红细胞悬液（浓度大反应完全易观察）

10:1抗凝剂加入采血管，采成年鸡血，用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤3-4次，每次以2000r/min离心3-4min，（上清夜保留2-8℃最多可保存7天）最后一次5min，吸取1ml加用磷酸缓冲盐水99ml配成1%红细胞悬液。

B3被检血清或被检稀释蛋黄：

B3.1 被检血清

每群鸡随机采血20-30份血样，分离血清。（不加抗凝剂）

采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6-8cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血样后以1000r/min离心5min，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0℃保存。

B3.2被检稀释蛋黄

取随机抽样的鸡蛋20-30份，弃去蛋清，蛋黄用移液管吸取1ml加稀释液1ml稀释后备用。

B4 操作方法：

B4.1 微量血凝试验

B4.1.1于微量血凝板（B1.1）的每孔中滴加稀释液（B2.1）50ul，共滴四排。

B4.1.2吸取1：5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再在第11列孔，各吸取50ul弃之。最后一列不加抗原作对照。

B4.1.3 于每孔中加入0.5%红细胞悬液（B2.3）50ul。

B4.1.4 置微型振荡器（B1.2）上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。

B4.1.5放室温下（18-20℃）30-40min，根据血凝图象判定结果。

以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。每次四排重复，以几何均值表示结果。（以平板底部出现血点，轻侧平板不出现流动的血线为完全凝集）

B4.1.6计算出含4个血凝单位的抗原浓度。按式（B1）进行计算：

抗原应稀释倍数=血凝滴度/4 ………………（B1）

B4.2微量血凝抑制试验

B4.2.1先取稀释液（ B2.1）50ul，加入微量血凝板（B1.1）的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3-12孔，每孔50ul，第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul。

B4.2.2吸被检血清（B3）50ul于第1孔（血清对照）中，挤压混匀后吸50ul于第2孔，依次倍比稀释至第12孔，最后弃去50ul。

B4.2.3置室温（18-20℃）下作用20min。

B4.2.4滴加50ul 1%红细胞悬液（B2.3.1）或被检稀释蛋黄B2.3.2于各孔中，振荡混合后，室温下静置30-40min，判定结果。（以平板底部出现血点，轻侧平板不出现流动的血线为完全凝集）

B5结果判定：

B5.1在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。

B5.2若有10%以上的鸡出现11（log2）以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城疫强毒感染。

B5.3若监测鸡群的免疫水平，则血凝抑制滴度在4（log2）的鸡群保护率为50%左右；在4（log2）以上的保护率达90%-100%；在以4（log2）下的非免疫鸡群保护率约为9%，免疫过的鸡群约为43%。鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示，如平均水平在4（log2）以上，表示该鸡群为免疫鸡群。