白水莉 章世元 刘大林
随着集约化高密度畜禽饲养方式的迅速发展，养殖环境问题已成为影响当前养禽业发展的重要因素之一。在畜牧生产实践中，人们为了追求较高的生产水平，提高经济效益，一方面所采用的生产方式和技术措施严重地背离了畜禽在长期进化过程中所形成的对环境条件的需求和生理规律，从而造成生产力低下，严重时引起畜禽大批死亡；另一方面与环境控制密切相关的禽舍环境温度得不到有效的控制，从而使大部分地区难以抵御夏季高温对家禽生产所带来的环境压力，给养禽业生产造成巨大损失。
高温热应激是畜禽生产中最常见的应激源，不论是夏季持续高温，还是季节交替的骤变高温，都会引起家禽生长受阻、繁殖力和肉品质下降，甚至引起多种疾病和家禽的大批死亡，给生产带来很大的经济损失。高温热应激问题的危害正日益突出并受到关注，因此，研究高温热应激问题及其作用机理、有效缓解和消除高温热应激将对提高禽类产品的竞争力和养禽业的经济效益有很大的现实意义。这已成为众多学者和畜牧生产者关注的一个热点问题。
1 热应激和热应激蛋白的概念
1.1 热应激的概念
由于外界环境温度过高，体温调节及生理机能紊乱而发生的一系列异常反应，并出现生产性能下降，甚至出现休克和死亡等现象叫热应激。往往蛋鸡处于25 ℃以上，肉鸡28 ℃以上就会出现热应激反应。
因为高温热应激源的刺激过强、过长或鸡体自身对应激源的致敏性增强时，鸡的正常生态环境发生改变，正常生理功能与生理状态发生异常。应激分为警戒期、抵抗期和疲劳期三个阶段。警戒期又分为两类即休克状态和抗休克状态。在警戒期的休克状态时鸡体内促肾上腺皮质激素(ACTH)的生成量和释放量增加，引起肾上腺功能亢进，肾上腺和垂体前叶增生肿大，最终导致肾上腺皮质激素分泌极度减少，此时机体抵抗力降低，若有病原菌侵入，极易发病，甚至死亡。
1.2 热应激蛋白的概念
从低等动物细菌到高等动物人类，受高温作用后均可发生热应激反应，此反应的特点是选择性合成一组多肽，称热应激蛋白(heat stress proteins, HSPs)，又称热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)、应激蛋白(stress proteins, SPs)，它是一种保护机体的蛋白。
2 热应激蛋白的类型
热应激蛋白(HSPs)普遍存在于从细菌到高等真核生物包括人的整个生物界，并且可以被氨基酸类似物、生长因子、重金属离子、病毒感染等多种因素诱导。热应激蛋白其实质并不是一个蛋白或一类蛋白而是一个庞大的家族。热应激蛋白家族是迄今为止发现的最为保守的遗传系统。根据氨基酸序列的同源性、分子量和功能的不同，HSPs可分为HSP110、HSP90（83～90 kDa）、HSP70（66～78 kDa）、HSP60、HSP40和小分子HSP（15～30 kDa）家族。
每个这样的HSPs族都由一个或多个不同形式或不同程度修饰的高度同源的蛋白质分子组成。同一族的成员除相对分子量大小相似以外，还具有一些共同的特征，不同种属的细胞含有相似的HSPs族，但不同族之间同源性较低。例如，HSP70与HSP90之间几乎没有同源性。此外，每一个特定的族在种族发育过程中是高度保守的，如细菌和人类的HSP70分子之间非常相似。在不同生物体中分布于相同细胞器中的热应激蛋白的相似性通常强于来源于同种生物却在细胞内定位不同的蛋白，这也表明各种HSPs族的功能与其在细胞内的分布有关。
3 热应激蛋白的特性
3.1 热应激蛋白基本特点
由于HSPs具有高度应激性和高表达性，提高了机体对应激的抵抗力，从而引发越来越多的学者对HSPs 的研究兴趣。HSPs 在进化上具有高度保守性，能与细胞蛋白结合行使功能，故又称为伴侣分子。总结前人研究成果，热应激蛋白存在以下特点：①在正常细胞中非应激状态下水平较低， 而应激状态下可迅速显著升高，可达正常水平的数十倍。②正常生理状态下，HSPs主要存在于细胞质中；应激状态时HSPs迅速进入细胞核和核仁；应激恢复期，又迅速进入细胞质；当再次应激时，HSPs返回细胞核。③HSPs可被多种刺激诱导而大量产生，具有应激反应普遍性。④HSPs可以提高细胞抗应激能力，其生成量与细胞的耐热力呈正相关。
HSPs基因除了在一定的真核细胞内表达外，这类基因还能够被一定的应激原激活，即当机体出现明显的平衡失调和生理性差异时，且这些差异影响着蛋白质结构的某些方面的功能，例如通过变性，使得氨基酸片段发生转换或共价修饰，从而获得应激。
3.2 热应激蛋白在抗热应激中热耐力的特点
热耐力是指机体对热作用的耐受能力，预先给生物以非致死性的热应激,可以加强生物对第二次热刺激的抵抗力,提高生物对致死性热刺激的存活率,这种现象称为热耐力。在高温等有害因素作用下，生物机体内出现应激反应，而热应激蛋白是否能被正常激活，决定了机体热耐力的形成。主要表现在生物体在接触亚致死温度后对致死性高温产生耐受性，热耐力提高以后，可以提高机体在致死高温下的生存能力。
人们通过许多实验从各个方面证实了HSPs与热耐力确实有关，表现如下：①当热应激时，许多生物和细胞的HSP70 可迅速被诱导，而且增加幅度很大。②随着HSPs表达增强，机体对热的耐受能力也迅速增强。③给正常细胞转入HSPs 基因,使其高表达,细胞热耐力增强。④使一个或几个编码HSPs的基因不表达, 细胞抗热休克能力减弱或消失。有人通过抑制或灭活细胞的基因表达，发现细胞热耐力降低。也有人用基因敲除（knock out）的方法去除细胞的HSPs基因,得到了相似的结果。⑤不同种属生物热耐力的差别与HSPs基因的表达程度密切相关。HSPs可以在机体热应激时加快正常蛋白质合成的恢复,使热休克时由于蛋白变性而造成的蛋白质量的减少得到补充,因此使机体获得热耐受力。
HSPs赋予细胞或生物从各种应激中恢复的能力,并保护它们免遭应激因素的损害。其中,表现最为明显的是热耐受能力的形成,即当细胞或生物接触非致死温度后,表现对致死温度的存活率明显提高。在热耐力的形成中,主要是热应激蛋白HSP70起主要作用。它的编码基因的5'端含有一段约 14对碱基的保守序列，对HSP70 mRNA的转录具有启动作用。在热应激反应时，热应激蛋白的变化主要取决于转录和翻译上的调节。转录水平主要由热应激转录因子（heat shock transcrirtional factors, HSF）调节，它能识别被称为热应激元件（heat shock element, HSE）的靶序列。
高温环境热应激可诱导几乎所有组织细胞合成HSP70，其细胞保护作用已基本确认，但HSP70增强热耐力的作用机制不完全清楚。普遍认为这种广泛存在、高度保守的HSP70是细胞保护的物质基础,作为对适应和抵抗热应激有重要作用的HSP70基因，在不同的地方鸡品种中可能存在差异。因此，有必要充分利用我国丰富的家禽基因库资源，从中寻找鸡HSP70基因的多态性，并阐明多态位点在不同鸡种中的分布特征，为研究和利用HSP70基因作为潜在的抗热性标记辅助选择的候选基因奠定基础。
在高温热应激源的刺激下，使热应激蛋白的含量增加的同时应激蛋白也可促使动物体温升高。据俄国《科学信息》杂志报道，俄罗斯科学院谢切诺夫生理进化与生物化学研究所和细胞学研究所专家通过实验证实：在高温、寒冷和感染等条件刺激下，动物体内的应激蛋白可促使动物体温升高，以提高机体免疫力。应激蛋白在活体细胞内部合成，可使生物细胞在应激反应中存活下来。俄国研究人员认为，细菌脂多糖是致病微生物细胞膜的一种成分，而应激蛋白既可以通过传播细菌脂多糖特有的感染信号的方式，又能通过从细胞外部刺激细胞的方式使负责发热反应的动物下丘脑前端工作起来，提高动物的体温，激发其免疫系统，从而提高机体的免疫能力。
4 热应激蛋白的功能
HSPs几乎存在于所有生物体内的各种细胞中，当细胞受到损伤时，均伴随着HSPs含量的增加，大量的资料表明，HSPs在热耐力形成过程中维持细胞内环境的稳定具有重要作用。一些资料表明热耐力与HSPs的表达呈正相关，因此现在普遍认为HSPs的功能主要在于稳定细胞的结构，使细胞维持正常的生理功能。热应激蛋白在细胞生长、发育、分化、基因转录，蛋白质的合成、折叠、运输、分解及其膜和细胞骨架的形成等多方面发挥着重要的作用。
4.1 HSP70家族的主要功能
HSP70家族包括分子量为72、73、75、78 kDa等的蛋白质，是HSPs家族中最丰富的一种，HSP70可参与蛋白质的代谢。高温热应激时,鸡体为了适应环境,各脏器组织充分发挥自我生理调节作用可诱导鸡大脑、肝脏、肺、心脏等组织中HSP70的产生增加。HSP70、HSP70 mRNA在各脏器组织中的表达水平各异。HSP70主要在心、肝组织中大量表达,且与肛温变化一致，可能是因体温升高，诱发热应激基因开放。Gabrief等在对肉鸡的热应激中发现HSP70 mRNA量在35 ℃、3 h达到最高值，这说明HSP70 mRNA受热诱导的增加具有时间依赖性。若应激过强或时间过长，HSPs在应激中表达量降低，导致细胞和机体严重受损。随着HSPs的增多,细胞存活率增高、受损轻,特别是热适应后细胞损伤更轻,显示出HSP70对细胞的保护作用。因此常把HSPs作为细胞损伤的一个客观指标和热应激的敏感指标。
4.2 HSPs其它家族的功能
近年来研究证实HSP60在自身免疫性疾病、传染病、慢性感染的发病中均发挥重要作用。HSP90在细胞内具有重要的生理功能，HSP90在组织细胞内有很高的基因表达，参与细胞周期调控，还参与免疫和免疫调节作用 。禽类HSP108最早发现于1981年，其主要功能是作为蛋白受体，具有免疫原性。由于应激反应的普遍性及HSPs高表达提高了机体对应激的抵抗力。
5 热应激蛋白在热应激中的作用机理
李培庆等应用3H-Dex放射配体结合的Scatchard分析和35S-蛋氨酸体外标记法分别测定了环境温度40 ℃热应激时，鸡外周血淋巴细胞(PBL)的糖皮质激素受体(GR)的最大结合容量(Ro)、平衡解离常数(Kd)及其热休克蛋白的表达，结果显示在热应激处理后0.5～4 h鸡细胞热休克蛋白(HSPs)的合成持续增加，在热应激最初0.5 h细胞总的蛋白合成迅速下降而HSPs合成增加，主要有HSP100、HSP90、HSP70和HSP25。在这些HSPs 4 h内合成增加的过程中，糖皮质激素受体（GR）含量迅速下降，细胞总的蛋白的合成也逐渐恢复。这可能由于HSPs广泛地参与到细胞骨架和核骨架的形成中，与细胞的功能有着密切的联系。因为核仁对热特别敏感，因此可以推测在热应激早期由于细胞核的受损从而使蛋白质合成的mRNA转录受阻，而抑制了蛋白质的合成。HSPs在热应激过程中对细胞结构和机能的重建，维持激素与糖皮质激素受体（GR）的亲合力，稳定受体蛋白结构，提高机体热耐受力具有重要意义。
Welch和Suhan在观察应激及应激恢复期哺乳动物细胞时发现经热休克的细胞，许多核蛋白变为不可溶并成为基质的一部分。在应激过程中合成的HSP70可向细胞核迁移并以亲水的方式结合到基质上，然后再集中到细胞核里，加速热休克的核仁恢复正常，修复被损伤的前核糖体。HSP25等小分子HSPs在热耐受方面尤为重要，它们在结构上具有较高的保守性，可以形成紧密的聚合结构——热休克颗粒。有实验证明，抑制小分子HSPs(22~32 kDa)产生，能够导致细胞热保护性丧失。另外，小分子HSPs还能参与聚合蛋白质的解聚和异常蛋白质的降解。因此，热休克过程中HSPs合成增加可增强细胞的热耐受力，促进和提高细胞从应激状态中恢复正常功能。热应激时诱导产生的大量的HSPs可能参与调节维持激素与受体的亲合力，稳定受体构象，以保证有效的受体数量，来发挥其生物学效应。
HSPs的合成可能参与稳定细胞内包括受体蛋白在内的其它蛋白的结构形成，促进变性蛋白的复原，对损伤的组织细胞有减轻再损伤的作用。因此，糖皮质激素（GC）、糖皮质激素受体（GR）及HSPs的综合调节对特殊环境下生物体的适应性生存具有重要意义。
6 小结
我们研究问题的最终目的是要寻找出解决问题的方法。通过对鸡热应激与热应激蛋白的作用机理的探讨，本人认为解决此问题可从以下几方面入手：①由于先天遗传因素对机体适应外界各种环境起着很大的作用，可利用基因导入法在培育鸡品种时，转入HSPs基因使其细胞能高度表达,来增强鸡的耐高温抗热应激能力。②利用热应激蛋白在热应激中热耐力的特点，在夏季高温天气到来之前可以人为逐步增加禽舍温度以使其能产生热耐力以便能适应夏季高温环境。
HSPs是生物体(或离体培养细胞)在应激因素作用下所产生的一组特殊蛋白质,它能保护机体(或细胞)不受或少受损伤。目前，迫切需要完善一系列的方法和热应激蛋白的理论，尤其是将基因组学及蛋白组学及分子生物学技术结合起来，应用于生产实践,使其在生命科学发展中发挥巨大的作用。
白水莉，扬州大学动物科学与技术学院，225009，江苏省扬州大学文汇路校区。
章世元（通讯作者）、刘大林，单位及通讯地址同第一作者。
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